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Soutenance de thèse

Caractérisation multi-échelle de capsides et de pseudo-capsides de bactériophages T5 par spectrométrie de masse

Vendredi 24 septembre 2021 à 14:00 - Salle 445, bâtiment 10.05, 17 rue des Martyrs, CEA-Grenoble - Vidéoconférence
Publié le 24 septembre 2021

​Par Kavya Clement
Équipe Étude de la Dynamique des Protéomes (EDyP)

La vaccination est la méthode la plus efficace de prévention et de contrôle des maladies infectieuses. Les stratégies actuelles de développement des vaccins ne permettent pas un large accès à la vaccination dans les pays en développement en raison de coûts élevés et de la nécessité de maintenir la chaine du froid. Les pseudo-particules virales (VLP) sont des structures virales recombinantes et qui possèdent les même propriétés immuno-protectrices que les virus natifs, mais ne sont pas infectieuses. Elles ont des applications en vaccination, mais également en thérapie génique et en préssentation d'antigènes. Si la pluspart des VLP sont dérivées de pathogènes affectant les humains, les virus de bactéries ont été proposés comme plateformes de présentation d'antigènes. Les capsides de bactériophages T5 exposent à leur surface 120 copies d'une protéine modifiable, et constituent un modèle intéressant de structure VLP pour la présentation d'antigènes.

Cette thèse propose une étude des capsides de bactériophage T5 utilisant une multiplicité d'approches basées sur la spectrométrie demasse (MS). Un aspect est de contribuer à la compréhension fine des processus d'assemblage des capsides en déterminant la stœchiométrie de la protéase de T5 par une approche de protéomique basée sur la MS et l'autre aspect est de caractériser l'intégrité et la stabilité des capsides de phage T5 en analysant leur masse totale par NEMS-MS.

la maturité de la capside de T5 débute avec l'activation d'une protéase appelée pb11, qui vient ensuite cliver d'autres protéines de structure. Malgré son importance pour la maturation dela capside, laquantité exacte de pb11 à chaque étape de l'assemblage est encore sujette à discussions. Le présent travail décrit une stratégie expérimentale originale de protéomique ciblée pour déterminer la présence et le nombre de copies de cette importante protéine dans les capsides matures, en utilisant un concatémère (QconCAT) de deux peptides isotopiquement alourdis.

la caractérisation d'assemblages supramoléculaires massifs composés de millions d'atomes, tels que les VLP est difficile, mais requise pour la production de vaccins. La spectrométrie de masse par capteurs nano-electro-mécaniques (NEMS-MS) est une technologie prometteuse pour étudier ces entités biologiques imposantes qui ont pour l'instant échappé à la mesure de masse. Les NEMS sont des dispositifs nanométriques, (leviers ou poutres suspendues), qui vibrent à leur fréquence de résonance. Lorsqu'une particule se pose à leur surface, la fréquence de résonance décroit proportionnellement à la masse déposée. Dans ce présent travail, nous étudions propriétés indépendantes de la masse des particules analysées qui peuvent affecter l'incertitude de mesure de masse par nano-résonateurs. Nous présentons une évaluation de la magnitude de ces effets sur la mesure de masse de capsides de bacteriophage T5 à l'aide de nano-poutres suspendues. Finalement, nous avons déterminé que la désolvatation incomplète des particules analysées affecte la mesure de masse bien plus largement que les paramètres physiques de la capside ou les imperfections de fabrication des dispositifs.

En conclusion, ce travail révèle le véritable nombre de copies de la protéase de T5 dans les capsides matures grâce à la protéomique par MS, etaborde les divers attributs et paramètres qui peuvent affecter la détermination de la masse de capsides intactes par MS sur nano-résonateurs.