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Fait marquant

AT_Chloro : première base de données AMT des protéines du chloroplaste


Après avoir développé une stratégie de protéomique innovante ciblée​​ sur les divers compartiments du chloroplaste hautement purifiés, nous avons [collaboration] développé AT_Chloro, la première base de données AMT dédiée à la plante modèle Arabidopsi​s thaliana. AT_Chloro représente une avancée significative car elle ouvre la voie à des études quantitatives systématiques permettant de comparer les protéomes chloroplastiques de mutants ou de suivre la dynamique de ces protéomes au cours du développement et dans des plantes soumises aux modifications de leur environnement.

Publié le 6 mars 2010
L’essentiel du carbone renouvelable est fixé par les organismes photosynthétiques grâce à leurs chloroplastes. Les plastes sont des organites semi-autonomes présents dans les plantes terrestres, les algues et quelques protistes. Site de la photosynthèse, les chloroplastes réalisent de nombreuses autres fonctions essentielles comme la synthèse d’acides gras, de lipides, d’acides aminés, de vitamines, etc. Ces biosynthèses nécessitent le fonctionnement coordonné de trois compartiments : les thylacoïdes, le stroma et l’enveloppe. L’approfondissement des connaissances des voies métaboliques du chloroplaste et de leur régulation est considéré comme déterminant dans la perspective d’une meilleure valorisation de la biomasse végétale. Enfin, comprendre les processus métaboliques du chloroplaste est essentiel si l’on veut analyser l’impact des modifications de l’environnement sur les plantes. Dans ce contexte, l’analyse protéomique s’est révélée être un outil de choix pour faire progresser de manière significative la connaissance du chloroplaste. 

Depuis plusieurs années, nous contribuons de manière significative à l’établissement de répertoires protéiques pour divers compartiments de la cellule d’Arabidopsis thaliana. Cependant, un des enjeux actuels de la protéomique est la réalisation d’études comparatives afin de suivre des processus dynamiques. Parmi les stratégies d'analyses protéomiques quantitatives qui ont été développées, la méthode AMT (Accurate Mass and time Tags) et celle dite de Spectral count ont permis à ces chercheurs d'établir la première base de données AMT pour un organite spécifique de la cellule végétale, le chloroplaste.
La base de données AT_Chloro a été établie en réalisant près de 500 analyses sur des fractions hautement purifiées des compartiments majeurs du chloroplaste (enveloppe, stroma et thylacoïdes). Des informations précises ont ainsi été obtenues pour 10654 peptides distincts (Figure 1) correspondant à 1323 protéines validées. L'ensemble des données a ensuite été structuré dans AT_Chloro, une base de données spécifique du chloroplaste d’Arabidopsis thaliana. La création de cette base de données permettra de réaliser les analyses ultérieures par nanoLC-FT-MS, en évitant le recours systématique à la MS/MS, ce qui permet d’augmenter significativement le débit d’analyse et la couverture du protéome étudié. Dans l’optique d’analyses protéomiques comparatives, la méthode AMT présente l'avantage de pouvoir comparer directement entre elles les intensités des signaux MS obtenus lors de l’analyse de différents échantillons protéiques complexes.


Figure 1 : Carte peptidique massique des ions (peptides) détectés par LC-MS dans le chloroplaste.
Axe des abscisses : temps de rétention des peptides sur la colonne nanoLC (min) ; Axe des ordonnées : masse isotopique des différents peptides (Da). Les différents états de charge (z) des peptides sont représentés par différentes couleurs : z=1 en bleu ; z=2 en rouge ; z=3 en vert.

L'association de l'AMT et du Spectral Count a permis d'obtenir à partir d’une seule et même analyse, les données d’identification et de quantification. Cette stratégie mise en œuvre pour la première fois a permis de déterminer la localisation sub-chloroplastique des protéines identifiées pour construire la base AT_Chloro.
Dans cette étude, un effort majeur d’annotation a été réalisé plus spécifiquement pour les protéines de l’enveloppe des chloroplastes, site privilégié des interactions entre les plastes et le reste de la cellule. Ainsi, près de 500 protéines (sur les 1323 protéines identifiées dans le chloroplaste) ont été identifiées dans l’enveloppe alors qu’elles ne représentent (en masse) que 1 à 2% des protéines du chloroplaste. Ces résultats confirment l’importance fonctionnelle de ce système membranaire. L’analyse protéomique réalisée a permis de replacer les protéines identifiées dans le contexte fonctionnel des voies métaboliques et du rôle que jouent l’enveloppe, le stroma ou les thylacoïdes dans le fonctionnement du chloroplaste (Figure 2).


Figure 2 : Compartimentation du métabolisme des composés terpéniques dans le chloroplaste déterminée à partir des données de protéomique semi-quantitative.
L’analyse protéomique par « spectral count » montre que les premières étapes (voies du méthylérythritol phosphate, du shikimate ou du protoporphyrinogène IX, par exemple) se déroulent dans le stroma (les protéines sont indiquées par des ronds oranges) ; puis, dès que les molécules deviennent hydrophobes, les voies métaboliques impliquent les membranes : soit les thylacoïdes (ronds verts), soit l’enveloppe (ronds jaunes). Les ronds bleus correspondent à des protéines dont la localisation fine n’a pas été possible. Les résultats démontrent en particulier le rôle majeur de l’enveloppe dans la biosynthèse des caroténoïdes (précurseurs entre autres de l’hormone ABA), des prénylquinones (plastoquinone, α-tocopherol) et de la protochlorophyllide, précurseur de la chlorophylle.

• La base AT_Chloro va au-delà d’un simple répertoire de protéines en présentant des données semi-quantitatives qui permettent de déterminer dans quel compartiment (enveloppe, stroma, thylacoïdes) se trouve une protéine du chloroplaste. Il est donc possible de préciser le rôle de chacun des compartiments dans les voies métaboliques du chloroplaste.
•  La base AT_Chloro, qui renferme une somme importante d’informations sur les protéines de l’enveloppe des chloroplastes, constitue une base de connaissance unique sur ce système membranaire.
•  AT_Chloro représente une avancée significative en ouvrant la voie à des études quantitatives systématiques permettant de comparer les protéomes chloroplastiques de mutants ou de suivre la dynamique de ces protéomes au cours du développement et dans des plantes soumises aux modifications de leur environnement.

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